علوم آزمایشگاهی دانشگاه آزاد تبریز-مهر89

عدسی های شیئی    درمیکروسکوپ های معمولی4عدسی شیئی برروی صفحه چرخان نصب شده است.وظیفه عدسی شیئی تهیه تصویربزرگ شده ازشیء موردنظراست.

عدسی های چشمی   وظایف این عدسی عبارتنداز:بزرگسازی تصویرمعکوس حاصله ازعدسی شیئی،تشکیل تصویرمجازی ازتصویرحاصله ازعدسی شیئی،اندازه گیری وسنجش اعضای واقع درتصویر. عدسی های چشمی دارای انواع مختلف می­باشندکه دونوع معروف آن عبارتنداز چشمی هویگنس(Huygenian)وچشمی رامزدن(ramsden). چشمی هویگنس متشکل ازدوعدسی سطح محدب می باشدکه یک طرف هرکدام مسطح ویک طرف محدب می باشد.

کاردیافراگم کاهش خیره کنندگی نوررسیده به چشم بیننده است. چشمی­های هویگنس به چشمی های منفی معروفند،اشکال عمده این عدسی­ها محدود بودن میدان دیدوعدم تأمین راحتی کافی برای چشم است.چشمی­های رامزدن به چشمی های مثبت معروفند،این چشمی­ها بادقت خوبی انحرافات عدسی­های آپکروماتیک راتصحیح می نمایند.

سیستم روشنایی  میکروسکوپ­ها دارای محدودیت های متعددی می باشند ولیکن درعمل اغلب روشنایی میکروسکوپ موجب ایجادمحدودیت هایی می شود بنابراین تلاش های بسیاری درضمینه تهیه روشنایی وروش­های تهیه روشنایی مناسب برای میکروسکوپ­ها گردیده است.پس تهیه نورمنسب می­تواندنقش مهمی دروضوح تصویرداشته باشد.روشنایی محیط نمی تواندبرای تهیه تصویرمناسب وکافی باشدلذادرتهیه روشنایی حتماً بایدازلامپ هاوچشمه های مصنوعی نوری استفده شود.لامپ های موراستفاده درمیکروسکوپ­هاعبارتنداز:1.لامپ هالوژن:این لامپ نورسفیدایجادمی­کند ومتشکل ازیک رشته تنگستن درگازهالوژن می­باشدحاصل ضرب شدت نورحاصله درطول عمر این لامپ­ها تقریباً ثابت است.ازلحاظ قیمت درمقایسه بالامپ جیوه وگزنون ارزانترمی­باشدوبرای کارهای فتومیکروگرافی مفیداست.2.لامپ های تنگستن درمیکروسکوپ های ارزان قیمت وآموزشی به کارمی­روند.3.لامپ گزنون:این نوع لامپ یک لامپ تخلیه الکتریکی است این لامپ­ها دارای پایداری بیشتری نسبت به لامپ های جیوه ای می­باشند.4.لامپ جیوه­ای:این لامپ همانندلامپ گزنون ازطریق تخلیه الکتریکی ایجادنورمی­نمایدلامپ جیوهای حاوی مقدارکمی جیوه است که دراثریونیزه شدن هوای داخل لامپ یون­های تولیدشده موجب تبخیرویونیزه شدن جیوه ها می­شوند.

کندانسور:

 وظیفه کندانسورمتمرکزسازی نوربرروی نمونه می باشدکندانسور درزیرstageکه محل قرارگیری نمونه است واقع می­شود.

                                                                                                                                                                                                                                           کندانسور آبه: این نوع کندانسورهامعمولاًدرمیکروسکوپ­های معمولی به کارمی­­روند دراین نوع کندانسورهادوعدسی بکاررفته است ودارای قیمت ارزان می­باشند.این کندانسورها با عدسی­های شیئی وآکروماتCFبا بزرگنمایی4xتا 100xبرای مشاهدات عمومی وکاربردهای تشخیصی مفید هستند.

·                                                                                                                                                                                                                                            کندانسور با عدسی متحرک:این کندانسوربرای فتومیکروگرافی همراه با عدسی­های شیئی وپلن آکرومات ازنوعCFمفید می باشند.

 کندانسورآکرومات:این کندانسوردرمشاهدات فتومیکروگرافی مورد استفاده قرارمی­گیرداین نوع کندانسورباعدسی های  شیئی 4xتا100xمی­تواندبه کاررود.

کندانسورآکرومات-آپلانت:این کندانسورهابرای فتومیکروگرافی جهت تصویرگیری ازاجزای بسیارریزمفیدمی­باشد.

چگونگی تشکیل ومشاهده تصویر:

نوربه صورت موج سینوسی پیوسته انتشارنمی­یابدولیکن می­توان تصورکرد که یک فوتون همچون یک بارولی باسرعت300000کیلومتردرثانیه حرکت می­کندوچون این ذرات به طورپی­در­پی درحال تعقیب یکدیگرند،لذادرعمل راهی جزنمایش آنهابه صورت یک موج پیوسته نیست.فوتون های نوری می­توانند دارای طول موج­های متفاوتی باشند،رنگ نوربه وسیله طول موج آن تعیین می­شود.اکثراً چیزهایی که به وسیله میکروسکوپ مشاهده می­شوندنسبت به نورشفاف می­باشندواجزای آنهاتنهاوقتی قابل مشاهده خواهدبودکه نسبت به زمینه دارای کنتراست باشند.وقتی نورسقیدبه یک جسم قرمزبتابدتمامی طول موج­های موجوددرنورسفیدبه جزنورقرمزدرآن جذب می­شودبنابراین یک جسم باناحیه قرمزرادریک زمینه سفیدبه خاطرآنکه دارای کنتراست رنگی می­باشدمی­توان دید.

نحوه کاربامیکروسکوپ درصورتی که باعدسی های 4و10و40کارکنیم به شرح زیراست:

1.قبل وبعدازکارعدسی هاراباتکه­ای ازپنبه خشک تمیزمی کنیم.

2.پایین کشیدن صفحه فیلدوپلاتین به وسیله ماکرومترتاحداکثرممکن.

3.ثابت نمودن نمونه یااسلایدیالام روی صفحه پلاتین به وسیله گیره.

4.روشن نمودن منبع نوری

5.تنظیم ارتفاع:برای این کابه وسیله پیچ ماکرومترودرمقابل عدسی100لام راتاحداکثرممکن بالامی­­آوریم تاحداقل فاصله راباعدسی100داشته باشد

6.قراردادن عدسی4وشروع مطالعه(اگرتنظیم ارتفاع صحیح باشدخودبه خودباعدسی4نمونه قابل مشاهده است)درمطالعه باعدسی4نورکم وکندانسوربسته است تنظیم باپیچ ماکرومترمی­باشد.

7.پس ازمشاهده باعدسی4نوبت به عدسی10می­رسددراین حالت نیزکندانسوربسته است وتنظیم باپیچ ماکرومتر خواهدبود

8.پس ازمطالعه باعدسی­های4و10نوبت به عدسی40می­رسددراین حالت کندانسوربازوتنظیم بامیکرومترصورت می­گیرد.

مراحل تنظیم باعدسی100به شرح زیراست:

برای مطالعه نمونه باعدسی100ازروغن ایمرسیون(روغن صدر)استفاده می­شود.بیشترین کاربردعدسی100درمشاهده باکتری­ها­،قارچ­ها،هیستولوژی،تخم انگل­هاخواهدبود.روغن ایمرسیون جهت افزایش ضریب شکست نوربه کارمی­رودضریب شکست برای محیط­های مختلف متفاوت بوده به طوری که برای هواn=1،برای آب معمولیn=1.2وبرای روغن ایمرسیونn=1.5است. برای تنظیم باعدسی100رعایت نکات زیرضروری است:

1.پس ازمشاهده باعدسی های4،10و40نوبت به مشاهده اجرامی باعدسی100می­رسد.

2.برای مشاهدهباعدسی100ابتدامثلثی فرضی با عدسی40و100ایجادمی­نماییم به نحوی کهنمونهموردنظردرزیر(قاعده)مثلث ودو عدسی40و100به عنوان اضلاع مثلث ماهستند،اکنون یک قطره روغن ایمرسیون دروسط قاعده مثلث قرارمی­دهیم.

3.سپس عدسی100را(فقط عدسی100)روی نمونه قرارمی­دهیم، این بارتنظیم بامیکرومتروکندانسوربازاست اکنونشروع به مطالعه نمونه می­کنیم.

4.به هیچ وجه لام روغن خورده باعدسی40مشاهده نخواهدشد.

میکروسکوپ الکترونی:

میکروسکوپ الکترونی نوعی میکروسکوپ مرکب است اولین میکروسکوپ مرکب احتمالاًدرسال­های1600میلادی توسط دونفرهلندی به نام هانس و زاکاریاس ساخته شد.درسال1873ارنست آبه ثابت کردکه برای تشخیص دقیق دوذره نزدیک به هم،طول موج نورنبایدبیشترازدوبرابرفاصله دوذره ازیکدیگرباشدبالاخره درسال1939اولین میکروسکوپ الکترونی ساخته شدمیکروسکوپ­های اولیه که میکروسکوپ­های ساده نام داشتندشامل فقط یک عدسی بودند،امامیکروسکوپ الکترونی که میکروسکوپ مرکب است ازترکیب حداقل دوعدسی به وجودآمده است درطول قرن هجدهم میکروسکوپ درزمره وسایل تفریحی به شمار می­آمد.باپژوهش­های بیشترپیشرفت­های قابل توجهی درساختن عدسی شیئی حاصل شد.به طوری که عدسی­های دیگربه صورت ذره بین های معمولی نبودندوخطاهای موجوددرآنهارفع شده بودومی توانستندجزئیات یک شیء رادقیقاًنشان دهند. پس ازآن درطی 50سال،پژوهشگران بسیاری تلاش کردندتا برکیفیت ومرغوبیت این وسیله بی­افزایندبالاخره ارنست آبه توانست مبنای علمی میزان بزرگنمایی میکروسکوپ را­تعریف کند.

میکروسکوپ مرکب ازازیک لوله تشکیل شده که دردوانتهای آن دوعدسی شیئی نزدیک به شیء موردمطالعه وعدسی چشمی قراردارد.تصویری که توسط عدسی شیئی به وجودمی­آید،به وسیله عدسی چشمی بزرگترمی­شود.به این جهت بزرگنمایی آن بیش ازقدرت یک عدسی است.درمیکروسکوپ های پیشرفته دستگاه نوری پیچیده تر است بدین ترتیب که درآن هاعلاوه برلامپ یک کندانسور(مجموعه عدسی های متمرکزکننده­ی نور)ویک دیافراگم که شدت نورراکنترل می­کند،قرارداده شده است.لامپی که دراین نوع میکروسکوپ هامورداستفاده قرارمی­گیرد،باولتاژکم کارمی­کندلامپ­های بسیاری برای این منظوروجوددارندکه هرکدام نوری باشدّت وطول موج موردنظرتأمین می­کنند،بنابراین برای تفکیک دونقطه نزدیکتراز2500آنگستروم بایدازمیکروسکوپ الکترونی استفاده کردزیراطول موج الکترون ازطول موج نورکمتراست.اولین میکروسکوپ الکترونی که ساخته شددرست مانند میکروسکوپ نوری که شعاع نورراازداخل نمونه موردمطالعه عبورمی­دهد،شعاع الکترون راازداخل مقطع بسیارنازکی عبورمی­دهد.چون تراکم مواددرتمام قسمتهای نمونه موردمطالعه یکسان نیست میزان الکترونی که ازقسمت­های مختلف عبورمی­کند متفاوت است درنتیجه تصویری ازقسمت­های تاریک وروشن آن به دست می­آید.میکروسکوپ الکترونی دارای یک قسمت لوله ای شکل است که الکترون می­تواندآزادانه ازآن عبورکند.دربالای لوله یک قطب منفی الکتریکی به شکل رشته سیم نازک وجودداردکه جنس آن ازتنگستن است،این قسمت آنقدرحرارت داده می­شودتابتواندازخودالکترون آزادکند.این عمل باایجاداختلاف پتانسیل از20000تا100000ولت بین کاتدوآندصورت می­گیرد.درنتیجه یک شعاع الکترونی به سوی پایین قسمت لوله ای شکل شتاب داده می­شود.به این سیستم تفنگ الکترونی می­گویند.درطول لوله عدسی های همگرااندازه وروشنایی شعاع الکترونی راقبل ازبرخوردبانمونه موردمطالعه کنترل می­کنند.مقطع موردبررسی روی یک صفحه مشبک دایره شکلی قرارداده می­شود.شعاع الکترونی پس ازعبورازمقطع وقبل ازاینکه به حدبزرگنمایی نهایی برسد،ازمیان عدسی های شیئی عبورکرده وتنظیم می­شود.سپس توسط عدسی­هایی برروی صفحه­ی زیرمیکروسکوپ منعکس می­شود،صفحه زیرمیکروسکوپ ازموادفسفردار(فسفیدروی)پوشانیده شده که درمقابل پرتوالکترون ازخودنورتولیدمی­کننددرزیراین صفحه یک دوربین عکاسی وجودداردکه ازتصویرروی صحنه عکس می­گیرد.

اطلاعاتی که میکروسکوپ الکترونی ارائه می­دهدعبارتنداز:

1.توپوگرافی شیء(نقشه برداری):دراین کاربامشخص کردن سطح وبافت داخلی شیء ،می­توان به خواصی مانندسفتی ومیزان ارتجاعی بودن آن پی برد.

 2.مورفولوژی(زیست شناسی):به دلیل اینکه دراین رؤیت شکل وسایرذرات مشخص است،می­توان به نیروی استحکام پی­برد.

3.ترکیب:این میکروسکوپ می­تواندعناصرسازنده شیء رامشخص نمایدبنابراین می­توان به خواصی مانندنقطه ذوب،اکتیویته شیء دست یافت.

4.بلورشناسی:میکروسکوپ الکترونی چگونگی چیده شدن اتم رادرمجاورت یکدیگرنشان می­دهدبه این ترتیب می­توان آنهاراازنظررسانایی وخواص الکتریکی بررسی نمود.

میکروسکوپ اختلاف فاز (phase contrast):

 مزیت میکروسکوپ اختلاف فازدراین است که می­توانیم باآن سلول­های زنده راباجزئیات بیشترمشاهده کرد.تیمارهایی مثل تثبیت نمونه می­تواننددگرگونی­هایی درساختاردرونی سلول به وجودآورندبنابراین مطالعه­ی سلول­های زنده که هیچ تیماری ندیده اند خیلی مطلوب است .می­توان فرآیندهایی مثل تقسیم میتوز(mitosis)درسلول­های زنده رانیزبااین میکروسکوپ­هامطالعه کرد.دربرخی مواردبرای عکس برداری پیوسته ودرازمدت ازسلول فعال، دوربینی به میکروسکوپ وصل می­شود.مطالعه سلول­های زنده بامیکروسکوپ تداخلی(interference microscope)ومیکروسکوپ زمینه سیاه(dark field)نیزمقدوراست.سیستم­های نوری خاصی درتمام این میکروسکوپ­ها وجودداردکه­به علت ویژگی آنهاتباین کافی بین اجزای سلول ایجادومشاهده سلول زنده­های مقدورمی­شود.استفاده ازمیکروسکوپ زمینه سیاه برای مشاهده باکتری معمول است که دراین موردایجادتباین بین سلول باکتری زنده ومحیط اطرافش مهم است.

 میکروسکوپ الکترونی نگاره:

میکروسکوپ الکترونی نگاره(scanning electron microscope)نوع ساده­تر میکروسکوپ الکترونی استبرای بررسی نمونه بااین میکروسکوپ نمونه بالایه­ای نازک ازفلزسنگین به طوریکنواخت پوشیده می­شودالکترون­های تابیده شده به سطح نمونه ازهیچ ناحیه­ای ازآن عبورنمی­کنند،بلکه دربرخوردبا سطح نمونه باعث تولیدالکترون­های بازتابیده می­شوند این الکترون­هاتشخیص داده شده وتصویری سه بعدی ازسطح نمونه حاصل می­گردد.

 این تصویر سلول­های خونی است که توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره گرفته شده است.

میکروسکوپ فلورسانت:

میکروسکوپ فلورسانت(fluorescent microscope) نع خاصی از میکروسکوپ نوری است که منبع نورآن پرتوهای فرابنفش است برای مشاهده نمونه زیراین میکروسکوپ­ها بخش­هایامولکول­های ویژه داخل سلول بامواد فلورسانت یانورافشان رنگ آمیزی می­شوند،زمانی که هدف ما تشخیص پروتیین­های خاص یاجایگاه آنهادرسلول باشدروش­های معمولی رنگ آمیزی که پروتیین­هارابه طورعام رنگ می­کنندقابل استفاده نیست.برای رنگ آمیزی اختصاصی معمولاًازپادتن­های اختصاصی متصل به موادفلورسانت استفاده می­شود.موادفلورسانت نوررادرطول موج فرابنفش جذب می­کنندودرطول موج بلندتری درطیف مرئی تابش می­کنندتصویری که دیده می­شودحاصل نورتابش شده ازنمونه است.رودامین و فلورسئین دونوع ازرنگ­های معمول فلورسانت هستندکه به ترتیب نورقرمزوسبزازخودتابش می­کنند.

میکروسکوپstmومیکروسکوپ پرتو ایکس:

Stmمخفف کلمهscanning tunneling microscopeاست این نوع میکروسکوپ در دهه­ی1970 اختراع شدومخترعان آن درسال1981جایزه نوبل دریافت کردند.نوآوریstmدراین است که درآن امواج نوری یاامواج نوع دیگربه کارگرفته نمی­شودوهیچ نوع عدسی درآن وجودنداردبیان دقیق نحوه کاراین میکروسکوپ خارج ازتوان این مطلب است ولی به طورخلاصه سوندی که نوک آن به اندارزه یک اتم است ویژگی­های نمونه رادرابعاداتمی بررسی می­کندstmساختارسطحی نمونه رابررسی می­کندامامیکروسکوپ مشابه دیگرویژگی­های الکتریکی،مغناتیسی ویادمای نمونه راتعیین می­کنددرحال حاضراین میکروسکوپ­هابرای نمونه­های زیستی وبیشتربرای نمونه­های غیرزیستی مورداستفاده قرارمی­گیرند.میکروسکوپ پرتوxنوع دیگری ازمیکروسکوپ­های نوین است که کاربردبیشتری برای نمونه­های زیستی داردقدرت جداسازی آن چندصدآنگسترم وضعیفتر ازمیکروسکوپ الکترونی است اما سلول­های زنده باآن قابل بررسی هستند.

میکروسکوپ ماوراء بنفش:

میکروسکوپ ماوراء بنفش یامیکروسکوپu.vکه منبع تغذیه نوراشعهu.vمی­باشدنسبت به میکروسکوپ نوری معمولی قدرت تفکیک بالاتری داشته چرا که اشعه ماوراء بنفش طول موج کوتاهتری نسبت به نورمرئی دارد.عدسی شیئی بکاررفته دراین میکروسکوپ ازجنس کورتزمی­باشد.به دلیل مضربودن اشعه ماوراء بنفش برای چشم انسان ازتصویرشیء عکس برداری شده وسپس برروی صفحه مانیتورمشاهده می­شودقدرت تفکیک این میکروسکوپ600 آنگستروم است.

میکروسکوپ زمینه سیاه :

منبع تغذیه نوردراین نوع میکروسکوپ نورمرئی می­باشدوباایجادانکسارنور توسط آینه های محدب ومقعر نمونه موردبررسی شفاف ونورانی درزمینه سیاه دیده می­شود.

اجزای مکانیکی ونوری میکروسکوپ نوری

اجزای نوری : این اجزاعمدتاًمشتمل برمنبع تغذیه نوروقطعات مرتبط باآن می­باشند،ازقبیل لامپ باولتاژ20وات،فیلترتصحیح نوروکندانسورکه کندانسور مشتمل بر پنج قطعه است که نورراتصحیح کرده وبرروی نمونه موردبررسی متمرکزمی­کند:1.فیلتررنگی(تصحیح نور)2.دیافراگم که حجم نورراتنظیم می­کند3.دوعددعدسی محدب4.پیچ نگهدارنده کندانسور5.پیچ تنظیم دیافراگم.

 اجزای مکانیکی :

1.پایه(base):کلیه قطعات میکروسکوپ برروی پایه سوارمی­باشد.2.دسته(handle):جهت حمل ونقل میکروسکوپ ازدسته استفاده می­شود.به هنگام جابه جایی میکروسکوپ آن رابرروی میزنمی­کشیم.

3.لوله میکروسکوپ(barrel):مشتمل برعدسی شیئی وعدسی چشمی که بابزرگنمایی های مختیف طراحی می­شوندعدسی شیئی دارای بزرگنمایی های 60x،x40،10x،4x،100xمی­باشدوعدسی چشمی دارای بزرگنمایی­های 18x،15x،10xمی­باشدکه بسته به نوع میکروسکوپ متفاوت می­باشد.

4.صفحه گردان(rovelver):عدسی­های شیئی برروی این صفحه قرارمی­گیرند.

5.پیچ حرکات تند(macrometrique): این پیچ  برروی دسته تعبیه شده است وباعث می­شودصفحه پلاتین باسرعت بیشتری درجهت عمودی جابه­جا شود.

6.پیچ حرکات کند(micrometrique):این پیچ برروی پیچ حرکات تندقرارداردوصفحه پلاتین رادرجهت عمودی ودرحدمیکرون جابه­جا می­کند.

7.صفحه پلاتین(platine plate):صفحه­ای که نمونه موردنظرروی آن قرارمی­گیردودرجهت طول وعرض دارای دوخط کش مدرج می­باشد که جهت ثبت ویادداشت مکان یک نمونه خاص به کارمی­رود.

8.پیچ طولی­عرضی : این پیچ زیرصفحه پلاتین قرارداردونمونه رابه راست وچپ می­برد.

منبع:www.rasekhoon.net